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Mar 29, 2023

L'architecture et le mécanisme de fonctionnement d'un organite urticant cnidaire

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 3494 (2022) Citer cet article

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Les organites urticants des méduses, anémones de mer et autres cnidaires, connus sous le nom de nématocystes, sont des armes cellulaires remarquables utilisées à la fois pour la prédation et la défense. Les nématocystes consistent en une capsule sous pression contenant un fil enroulé en forme de harpon. Ces structures sont à leur tour construites au sein de cellules spécialisées appelées nématocytes. Lorsqu'elle est déclenchée, la capsule se décharge de manière explosive, éjectant le fil enroulé qui perfore la cible et s'allonge rapidement en se retournant dans un processus appelé éversion. En raison de la complexité structurelle du fil et de la vitesse extrême de décharge, la mécanique précise du déclenchement des nématocystes est restée insaisissable7. Ici, en utilisant une combinaison d'imagerie en direct et de super-résolution, de microscopie électronique 3D et de perturbations génétiques, nous définissons la séquence étape par étape de l'opération du nématocyste dans l'anémone de mer modèle Nematostella vectensis. Cette analyse révèle les transformations biomécaniques complexes qui sous-tendent le mécanisme de fonctionnement des nématocystes, l'une des micro-machines biologiques les plus exquises de la nature. En outre, cette étude fournira un aperçu de la forme et de la fonction des organites cnidaires apparentés et servira de modèle pour la conception de microdispositifs bioinspirés.

Les nématocystes cnidaires sont des armes subcellulaires complexes avec des formes et des fonctions hautement spécialisées1,2. Les nématocystes sont des organites intracellulaires dérivés de Golgi composés de fils venimeux enfermés dans une capsule pressurisée3,4. Lorsqu'elle est déclenchée, la capsule se décharge, éjectant son fil comme un harpon qui pénètre les cibles, délivrant un cocktail de neurotoxines5,6,7,8,9,10. Au niveau cellulaire, la décharge des nématocystes fait partie des processus mécaniques les plus rapides de la nature, connus pour être achevés en 3 millisecondes dans les nématocystes d'Hydra11,12. Les mesures effectuées sur vidéo à haute vitesse des sténoteles Hydra révèlent que la phase initiale de l'explosion de la capsule sous pression et l'éjection subséquente du fil se produisent en aussi peu que 700 nanosecondes12. Cette étape initiale de décharge explosive est comparable à d'autres systèmes de projectiles ultra-rapides trouvés dans la nature tels que la décharge de spores fongiques, l'éjection de pollen et la décharge des organites balistiques des dinoflagellés13,14.

Des études antérieures indiquent que la vitesse élevée de décharge des nématocystes est entraînée par l'accumulation de pression osmotique à l'intérieur de la capsule par une matrice de polymères poly-γ-glutamate (PG) liant les cations et la paroi élastiquement étirée de la capsule libérant de l'énergie par un puissant mécanisme de type ressort pendant la décharge2,12,15,16. Lors du déclenchement, mais avant la décharge, la capsule double approximativement de volume en raison de l'afflux rapide d'eau17. Cela fait gonfler la matrice par osmose et étire la paroi de la capsule2,18. Cette énergie est ensuite utilisée pour éjecter le fil à grande vitesse, qui impacte et pénètre le tissu cible. Les phases ultérieures de la décharge du nématocyste impliquent l'allongement du fil, qui se déroule sur une échelle de temps plus lente et se termine en millisecondes11. Au cours de cette phase, le fil du nématocyste subit une transformation de forme, se retournant à travers un processus appelé éversion qui est causé par la libération de la pression générée par osmotisme et de l'énergie élastique stockée dans le fil17,19,20. Ainsi, le nématocyste fonctionne en phases distinctes qui impliquent une phase initiale de perçage de la cible et des phases ultérieures d'éversion pour former une lumière.

Les caractéristiques des nématocystes varient considérablement entre les différentes espèces de cnidaires, présentant une diversité de taille de capsule et de morphologie de fil, mais toutes conservent un mécanisme de fonctionnement similaire impliquant un tubule éversible entraîné par une éjection explosive2,21,22,23. Pour explorer la biologie des nématocystes dans un système génétiquement traitable, nous interrogeons ici le fonctionnement du fil du nématocyste chez l'anémone de mer Nematostella vectensis. Nematostella abrite deux types de nématocystes : les p-mastigophores microbasiques et les isorhizes basitricheux, ces derniers ayant des variétés courtes et longues24,25. Chez les anémones de mer, les capsules de nématocystes sont scellées par trois volets apicaux reliés au fil urticant26,27,28. Ce fil est composé de deux sous-structures distinctes : une tige courte, rigide et fibreuse et un tubule long et fin orné de barbes17,22. La tige est composée de trois filaments enroulés en hélice et est initialement éjectée sous forme de projectile comprimé, perçant la cible, puis se renverse pour former une lumière à travers laquelle le reste du fil, le tubule, est libéré17. Bien qu'il soit connu que l'éversion de l'arbre implique une transformation géométrique d'une bobine étroitement comprimée en une seringue creuse, les mécanismes entraînant ce processus sont mal compris. De plus, l'éversion du tubule diffère significativement de celle de la tige triple hélicoïdale, car le tubule s'éversion en tournant à l'envers en l'absence de filaments hélicoïdaux26,29. La libération de pression et d'énergie élastique stockée dans la capsule est théoriquement suffisante pour entraîner l'éjection et la pénétration initiales de l'arbre, cependant, des sources d'énergie supplémentaires sont susceptibles d'être nécessaires pour un allongement supplémentaire du fil5,19,20. En raison de la rapidité et de la complexité de ces événements, les étapes précises de la décharge et de l'éversion sont jusqu'à présent restées insaisissables.

Ici, nous démontrons la composition structurelle et les transformations mécaniques de l'arbre et du tubule au cours de phases distinctes de décharge de nématocyste chez Nematostella, et rapportons en outre le mécanisme de fonctionnement des sous-structures de fil de nématocyste. Notre analyse révèle la structure complexe et les transformations biomécaniques sophistiquées qui sous-tendent le mécanisme opérationnel des nématocystes.

Pour comprendre la distribution des cellules piquantes (nématocytes) et de leurs nématocystes chez Nematostella, nous avons d'abord créé une lignée transgénique exprimant l'EGFP dans les nématocytes sous le contrôle de la région promotrice de la nématogalectine (nématogalectine> EGFP; Fig. 1a). La nématogalectine est un composant majeur du nématocyste, et elle est incorporée dans la structure du fil au cours de sa morphogenèse30. On pense que cette protéine agit comme un substrat pour l'assemblage d'autres protéines structurelles dans le fil, ainsi son expression temporelle définit une fenêtre utile pour visualiser les nématocytes30. L'imagerie en direct de polypes primaires transgéniques a montré que les tentacules étaient fortement peuplés de nématocytes EGFP + portant les basitrichs de forme longue (Fig. 1aI). La colonne du corps était peuplée de la variété la plus courte ainsi que de quelques p-mastigophores. Curieusement, nous avons découvert que les nématocytes étaient connectés par des processus de type neurite qui formaient des réseaux locaux (Fig. 1aII, flèche). Les nématocytes sont connus pour former des synapses et agir comme des afférences ou des effecteurs, mais peuvent également fonctionner de manière autonome31,32,33,34. Ainsi, les réseaux observés pourraient fonctionner dans la régulation du comportement collectif et de l'activité coordonnée des populations de nématocytes35. Dans les nématocytes EGFP +, la fluorescence a été détectée dans tout le cytoplasme et l'appareil sensoriel, mais a été exclue de la capsule (Fig. 1b). La paroi et le fil de la capsule sont constitués, en partie, de minicollagènes qui permettent la construction d'une variété de fibres structurelles par réticulation36,37,38,39,40,41. Nous avons exploité cela pour visualiser le contenu de la capsule en traitant des animaux vivants avec du TRITC fluorescent qui a été incorporé dans le fil du nématocyste au cours de sa maturation, vraisemblablement par une réaction avec des minicollagènes42,43.

a Nématocytes (vert) d'un polype primaire transgénique de N. vectensis exprimant l'EGFP sous le contrôle du promoteur de la nématogalectine aI expression de l'EGFP à l'extrémité du tentacule. aII expression EGFP sur la colonne du corps. La flèche pointe vers le réseau de processus cellulaires reliant les nématocytes. Les images sont représentatives des tentacules de polypes primaires et des colonnes de corps de 6 pontes. b Vue rapprochée d'un seul nématocyte sur la colonne corporelle d'un polype primaire exprimant l'EGFP dans les nématocytes (vert). L'appareil cnidocil (capteur), le corps cellulaire et les processus de type neurite sont présentés. TRITC (magenta) marque la capsule, l'arbre positionné au centre et les plis du tubule (n = 10 colonnes de corps de polype primaire, cinq expériences). c Morphologies des nématocystes chez N. vectensis basées sur le signal de fluorescence du TRITC incorporé. Capsules isorhizas basitricheuses (n = 19 courtes, n = 20 longues) avec une tige densément marquée (flèche) et un tubule enroulé (flèche en pointillés) continu avec la tige comprimée (panneaux de gauche et du milieu). Capsules microbasiques p-mastigophores (n = 10) arbre (flèche) avec son encoche en forme de V distinctive (panneau de droite, flèche en pointillés) Images représentatives de nématocystes purifiés d'environ 300 polypes primaires). Barres d'échelle 1 μm. d Coupe longitudinale d'un nématocyste montrant des filaments de tige densément enroulés (bleu), une partie du tubule enroulé (magenta) et les deux régions de connecteur, le connecteur capsule-tige et le connecteur tige-tubule (jaune). Les lambeaux apicaux sont vus dans une conformation partiellement ouverte (encadré en pointillés). La reconstruction 3D correspondante de la section longitudinale montre la capsule, l'arbre central (bleu), une partie du tubule attaché (magenta), les régions du connecteur (jaune) et les volets apicaux (boîte en pointillés). e Coupe transversale d'un nématocyste montrant la paroi de la capsule, la tige lamellaire dense et le tubule en forme d'hélice. (n = 2 images de capsules de volume complet provenant d'environ 350 capsules visibles dans 2 échantillons de polypes primaires.

Dans les nématocystes de type basitrich, l'incorporation de TRITC n'a été observée qu'après l'invagination du fil (Fig. 1a supplémentaire, flèches). En revanche, les nématocytes abritant des fils en maturation étaient dépourvus de TRITC (Fig. 1a supplémentaire, flèches en pointillés). Cela suggère que le colorant s'accumule spécifiquement dans les parties invaginées du fil à l'intérieur de la capsule. Nous avons constaté que l'inactivation médiée par le shRNA du gène de type nématogalectine Nemve1_232014 entraînait des capsules anormales et empêchait la formation de fils (Fig. 1b supplémentaire). Cela suggère que les lectines jouent un rôle essentiel dans la morphogenèse des fils et des capsules (Fig. 1b supplémentaire, flèches en pointillés). Nous avons en outre confirmé que le knockdown entraînait une réduction par deux de l'expression de l'ARNm de Nemve1_232014 par qPCR, ce qui suggère que cette protéine doit être présente en abondance pour un assemblage correct du fil et de la capsule (Fig. 1c supplémentaire). En utilisant une combinaison de marquage nématogalectine> EGFP et colorant TRITC, nous avons ensuite analysé l'architecture du fil depuis son développement jusqu'à sa morphologie finale après le tir (Fig. 1b, c; Film supplémentaire 1). Contrairement à la tige dense des p-mastigophores (Fig. 1c, flèches), dans laquelle l'intensité du colorant était très élevée par rapport au tubule, le TRITC fluorescent s'incorporait avec une intensité similaire à la fois dans la tige et le tubule des basitrichs (Fig. 1c, flèches en pointillés). L'étiquetage plus uniforme des basitrichs et leur prévalence dans les polypes primaires nous ont amenés à étudier le fonctionnement du fil dans ce type de nématocyste.

Pour analyser la structure de l'arbre et du tubule et ainsi déterminer leur fonctionnalité, nous avons ensuite effectué une reconstruction 3D de capsules basitrich non déchargées à partir de coupes en série en utilisant la microscopie électronique à balayage (SEM; Fig. 1d; Film supplémentaire 2). Nous avons constaté que la tige comprimée était constituée de filaments étroitement enroulés alignés verticalement sur l'ouverture de la capsule formée par les volets apicaux (Fig. 1d, encadré). Les filaments étaient des structures composites avec des piles de lamelles construites à partir de couches denses et transparentes aux électrons. Ces résultats confirment une structure lamellaire triplet similaire à celle observée chez Anemonia sulcata par Godknecht et Tardent (1988), qui ont noté que la pointe de la tige est formée de lamelles décalées convergeant vers une petite zone pointant vers l'ouverture de la capsule17.

Une inspection minutieuse de nos données SEM a en outre révélé que la paroi du fil enveloppant les filaments de l'arbre était reliée aux volets apicaux avec un connecteur lâche capsule-arbre. Un connecteur arbre-tubule similaire était situé entre l'extrémité basale de l'arbre et l'extrémité apicale du tubule. Le tubule était tordu, formant des plis en segments réguliers dans le sens de la longueur (Supplemental Movies 2, 3). Dans les sections transversales de la capsule, on a observé que les lamelles de l'arbre étaient étroitement enroulées et comprimées, tandis que la section transversale du tubule présentait une structure en forme d'hélice (Fig.1e; Film supplémentaire 4).

Pour déterminer les phases distinctes du fonctionnement du fil, nous avons ensuite enregistré des films fluorescents à grande vitesse d'événements de décharge chez des animaux marqués au TRITC (films supplémentaires 5 à 7). Après stimulation in situ des nématocytes, la tige comprimée a d'abord été éjectée sous la forme d'un projectile dense qui s'est ensuite rapidement dilaté pour former un cylindre allongé à travers lequel le tubule a émergé (Fig. 2aII – aIV, flèches; Film supplémentaire 5). Sur la base de ces observations, nous avons défini trois phases principales du fonctionnement du nématocyste : la décharge de l'arbre (Phase I), l'éversion de l'arbre (Phase II) et l'éversion des tubules (Phase III ; Fig. 2, encadré). En utilisant SEM, nous avons visualisé l'ultrastructure de l'arbre de décharge. À l'état non déchargé, nous avons observé des lamelles clairsemées décorant la région où la tige s'effilait vers le connecteur capsule-tige (Fig. 2b, flèche en pointillés). Au cours des premières étapes de la décharge, le connecteur capsule-arbre renversé a formé une jupe autour de l'arbre traversant, créant une structure à double paroi (Fig. 2c, flèche) avec l'arbre non inversé se déplaçant vers l'avant à l'intérieur du connecteur (Fig. 2c, bleu). Le connecteur capsule-arbre éversé était recouvert extérieurement de filaments clairsemés ressemblant à des épines irrégulières provenant de l'éversion des lamelles observées à l'état non déchargé (Fig. 2c, flèche en pointillés). Les sections SEM en série ont également capturé un connecteur éversé (Fig. 2d, flèche) dans lequel le tubule pouvait être observé au départ de la capsule (Fig. 2d, flèche en pointillés; Film supplémentaire 8). Enfin, dans les coupes SEM d'un fil de nématocyste partiellement déchargé, nous avons observé le tubule non inversé traversant à l'intérieur de sa fraction éversée, qui était décorée à l'extérieur de barbes creuses (Fig. 2e, flèche; Film supplémentaire 9).

a Imagerie en direct de la décharge de nématocyste. Les nématocystes marqués au TRITC ont été déchargés in vivo et les cadres ont été capturés à des intervalles de 5 millisecondes. aI–aIV Instantanés montrant des phases distinctes correspondant à la décharge de l'arbre et à l'allongement des tubules. Remarque : L'éversion de l'arbre (Phase II) était trop rapide pour être capturée dans cette séquence. b Coupe longitudinale d'une capsule (C) avant la décharge montrant la tige non inversée (US) et sa conicité (flèche en pointillés) jusqu'au connecteur tige-tubule (jaune, flèche), les volets apicaux (en forme de V) et le tubule non inversé (magenta). c Coupe longitudinale d'une capsule déchargée lors de l'éversion de la diaphyse. Les filaments de l'arbre non inversés (États-Unis, bleu), le connecteur capsule-arbre (à l'extérieur de la capsule, jaune), une partie du tubule (magenta) et le connecteur arbre-tubule (jaune). d Coupe longitudinale d'un connecteur arbre-capsule éversé (jaune, flèches) et traversant un tubule non éversé (UT, magenta, flèche pointillée). e Coupe longitudinale d'un tubule partiellement éversé. L'arbre éversé (ES, bleu, flèche), le connecteur capsule-arbre (jaune, flèche pointillée), les parties du tubule non inversé (UT, magenta) à l'intérieur du tubule éversé (ET) et les barbillons (B) sont affichés. f Un fil de nématocyste partiellement éversé révélé par l'incorporation de TRITC montrant les filaments de l'arbre éversé (ES), le tubule non éversé (UT, centre) et les barbes (B) décorant la partie éversée du tubule (ET). Coupes transversales EM correspondantes : fI Coupe transversale du tubule. Les étiquettes indiquent les segments de tubules éversés et non éversés avec des barbes (B) situées au centre. fII Section oblique du tubule partiellement éversé montrant des segments de tubule et des barbes à l'extérieur (B). fIII Coupe transversale du puits éversé (ES) et du tubule traversant non éversé (UT). Les couches denses et transparentes aux électrons des filaments ES (flèche) ont été montrées. g Un nématocyste partiellement déchargé coloré avec de l'agglutinine de germe de blé conjuguée à un colorant fluorescent (WGA, magenta) et du TRITC (vert). Régions agrandies : gI Le connecteur diaphysaire-tubule (flèche) et le tubule éversant émergeant avec des barbes (flèche en pointillés). gII Les filaments de la tige (vert, flèche) et la paroi du fil marqué WGA (magenta). gIII Le connecteur capsule-arbre (flèche) montrant la paroi du fil (WGA, magenta) et le tubule traversant non inversé (TRITC, vert, flèche en pointillés). h Images représentatives des phases distinctes de l'éversion du fil. La coloration fluorescente montre les transformations géométriques dans chaque phase. Les flèches indiquent le sommet du fil lors de phases distinctes.

Pour mieux comprendre les changements structurels décrits ci-dessus, nous avons ensuite analysé des images en super-résolution de fils marqués au TRITC subissant une éversion. Cette approche nous a permis de démontrer l'existence d'une triple géométrie hélicoïdale des filaments de l'arbre non enroulés avec le tubule traversant non inversé qui pourrait être tracé par le marquage des barbes (Fig. 2f). Fait intéressant, la paroi du fil n'incorporait pas de TRITC et était invisible dans les images fluorescentes, mais pouvait être vue dans les coupes transversales SEM correspondantes comme une couche transparente aux électrons qui enfermait le tubule non inversé dans son état compacté (Fig. 2fI, fII). La disposition très ordonnée des barbes dans le tubule non inversé indique que ces structures sont empilées en une colonne, qui apparaît comme un filament unique dans les images fluorescentes (Fig. 2f, fI). De plus, des coupes transversales SEM à travers l'arbre ont montré que ses filaments étaient constitués de lamelles qui enfermaient le tubule traversant non inversé, comme on le voit sur les images fluorescentes (Fig. 2f, fIII, flèche).

Pour visualiser la paroi du fil qui était autrement invisible dans les images optiques, nous avons ensuite concentré notre attention sur d'autres composants du fil. Avec les minicollagènes, les nématocystes d'Hydra et de Nematostella contiennent des glycanes et présentent des similitudes avec la matrice extracellulaire en composition44,45,46,47,48. La lectine spécifique des nématocystes, la nématogalectine, agit comme un échafaudage reliant les minicollagènes aux glycanes, principalement constitué d'une gaine de chondroïtine non sulfatée30,46,49. Compte tenu de la présence de lectines dans la structure, nous avons émis l'hypothèse que la présence de GAG ​​pouvait être détectée avec des lectines de liaison au sucre marquées par fluorescence. Ainsi, nous avons coloré les nématocystes déchargés avec de l'agglutinine de germe de blé (WGA) conjuguée à un colorant fluorescent, qui est sélective pour les chaînes GlcNAc, et avons constaté que la WGA était fortement liée à la paroi du fil transparent aux électrons (Fig. 2g)50. La co-coloration avec WGA et TRITC a montré que le matériau coloré par WGA ne se co-localisait pas avec TRITC, mais formait plutôt un stratifié avec les structures marquées au TRITC. Enfin, des images de fils dans un état d'éversion précoce ont montré que l'arbre marqué au TRITC entourait la paroi du tubule marqué au WGA. Les régions de connecteur dépourvues de filaments ou de barbes qui étaient mal marquées au TRITC étaient plus fortement marquées au WGA fluorescent (Fig. 2gI – gIII).

Il est important de noter que nous avons observé que le marquage TRITC chevauchait les filaments de la tige dans le canal de transillumination, ce qui suggère que les fibres de la tige abritent un matériau marqué au TRITC (Fig. 2a supplémentaire, flèches). En revanche, le marquage WGA fluorescent a été enrichi à l'intérieur, entourant la structure du mur. La couche WGA a formé des lamelles répétitives avec les régions marquées au TRITC mais ne se chevauchait pas avec le matériau marqué au TRITC (Fig. 2b, c, TRITC supplémentaires, flèches; WGA, flèches en pointillés). En combinant le marquage TRITC et WGA avec la coloration par anticorps du minicollagène Ncol4, nous avons déterminé que le signal TRITC était présent dans les fils des capsules matures uniquement là où le fil est invaginé. Le TRITC n'a pas étiqueté les capsules en cours de maturation, qui peuvent être colorées avec le minicollagène de Nematostella Ncol4, comme indiqué par Zenkert et al. (2010)24,25. Dans les extrémités des tentacules, les capsules en développement profondément à l'intérieur de l'ectoderme sont colorées avec l'anticorps Ncol4, tandis que les capsules complètement mûres tapissant la surface de l'épithélium des tentacules ne sont pas colorées (Figs. 3, 4, flèches supplémentaires). En conclusion, ces résultats suggèrent que le fil se compose de deux couches : une couche marquée au TRITC formant les filaments et les barbes détectables par le TRITC, et une couche marquée au WGA formant la paroi cylindrique globale du fil, y compris les régions du connecteur, la paroi de la tige et la paroi du tubule.

Des études structurelles de fils de nématocystes pénétrant dans des substrats de gel indiquent que l'éversion de la tige est initiée à l'apex de la tige17. Pour déterminer comment l'arbre passe de son état comprimé à une structure lâche à triple hélice, nous avons capturé les premiers stades de la décharge en traitant les polypes primaires de Nematostella avec une solution qui déclenche simultanément la décharge et fixe rapidement les échantillons24. La séquence d'événements reconstruite à partir d'images fixes a révélé la transformation géométrique complexe de la tige à sa sortie de la capsule dans une configuration enroulée (Fig. 2h et Fig. 5a supplémentaire, flèches). Nous avons constaté que pendant la décharge de l'arbre (phase I), l'arbre éjecté continuait à avancer comme un projectile dense à l'intérieur du connecteur capsule-arbre jusqu'à ce que le connecteur atteigne sa longueur maximale. Au cours de l'éversion de la tige (phase II), les filaments ont commencé à se dérouler du sommet de la tige, se retournant, s'éversant ainsi, tandis que l'extrémité basale de la tige avançait à l'intérieur des filaments déroulés (Fig. 5b supplémentaire). La pointe éversée de l'arbre présentait une structure en forme de fer de lance (Fig. 5c supplémentaire, flèche). Le tubule était attaché à l'extrémité basale de la tige par le connecteur tige-tubule et était ainsi tiré à travers la lumière nouvellement formée à l'intérieur des filaments de tige déroulés. Ce mouvement a entraîné une éversion complète des trois filaments où l'ancienne extrémité apicale de la tige est devenue son extrémité basale. Enfin, la lumière de la tige éversée s'est ouverte, permettant le mouvement du connecteur tige-tubule, initiant la phase III. L'émergence de barbes sur l'extérieur du tubule éversé a délimité une limite entre le connecteur arbre-tubule et le tubule lui-même, et a ainsi marqué le début de l'éversion du tubule (Fig. 2gI; Fig. 2h, dernier panneau. Fig. Supplémentaire 5a, dernier panneau). Dans l'ensemble, ces données indiquent que l'éversion de l'arbre exécute une série reproductible de transformations physiques qui impliquent le déroulement et le mouvement vers l'avant de ses filaments.

Les images SEM et fluorescentes ont révélé des différences de composition et de structure entre la tige fibreuse à triple hélice et le tubule cylindrique lisse (Fig. 3a, b). Alors que l'éversion de la tige peut s'expliquer par le mouvement de trois filaments, le tubule n'a pas une telle géométrie et se retourne probablement par un mécanisme qui implique le dépliage et la détorsion de la paroi du tubule19,29. L'imagerie en direct a révélé que pendant l'allongement du tubule, le tubule se déplaçant vers l'avant se détordait et se détendait jusqu'à un état cylindrique (Fig. 2aIII – aIV ; Fig. 3b, étapes 1, 2 ; Film supplémentaire 5). À l'extrémité éversée, les torsions hélicoïdales du segment du tubule éversé pouvaient être observées en raison de la concentration de coloration WGA le long des poches à barbillon (Fig. 3c). En revanche, dans une image capturée peu de temps après le début de l'éversion du tubule, le tubule était considéré comme une structure cylindrique à double paroi avec une lumière entre les parois non inversée et éversée, ce qui suggère qu'il s'est probablement détendu et détordu rapidement (Fig. 3d, flèches). Ces résultats indiquent que l'éversion du tubule se produit probablement par étapes impliquant la détorsion de sa forme en forme d'hélice en une conformation cylindrique, et que l'action du segment éversé qui se détorde et se détend alimente le tubule non inversé restant jusqu'à l'extrémité distale.

une image SEM (n = 6, 2 expériences) de l'arbre (flèche), du tubule et des barbes disposées en hélice (flèche en pointillés). b Image fluorescente d'un tubule partiellement éversé. Les filaments et barbes de l'arbre (TRITC, vert) et la paroi du fil (WGA, magenta) sont montrés (n = 10 tentacules de polypes primaires, 3 expériences). Barres d'échelle 2 μm. c Image en super-résolution de la pointe du tubule éversé (étape 1) (n = 20 fils d'un tentacule de polype primaire). Les barbes (TRITC, vert), le tubule (WGA, magenta), les canaux combinés sont représentés. Barres d'échelle 0,5 μm. d La pointe d'un tubule éversé (stade 2) (n = 8/30 fils à double paroi d'un tentacule de polype primaire). La paroi du tubule (magenta), sa structure à double paroi (panneau central gauche, flèche) et les barbillons (panneau central droit, flèche) sont affichés. Illustration de l'étape 2 (panneau de droite). Barres d'échelle 1 μm. e Structure des barbes du tubule (flèches) dans le contrôle de brouillage (n = 0/20 fils partiellement déchargés d'un tentacule de polype primaire) et v1g243188 (n = 20/20 fils partiellement déchargés d'un tentacule de polype primaire) échantillons de shRNA KD (flèche pointillée). La luminosité a été ajustée pour visualiser les threads v1g243188. Barres d'échelle 2 μm. f Effets du brouillage et du renversement v1g243188 sur les barbes (TRITC, vert) et la paroi des tubules (WGA, magenta). Les flèches indiquent les barbes désorganisées (n = 25/25 fils par rapport au brouillage (n = 0/25 fils). La luminosité a été ajustée pour visualiser les fils v1g243188. Représentatif des fils partiellement déchargés des tentacules de polypes primaires (Scramble, n = 27 tentacules de polypes primaires; v1g243188, n = 25 tentacules de polypes primaires, n = 5 expériences de shRNA knockdown). barres 1 μm. g Un fil complètement éversé étiqueté avec TRITC et WGA (n = 15 fils purifiés et déchargés). La flèche indique un vrillage au niveau d'un site de tubule distal. gI Connecteur de l'arbre de la capsule (flèche) et l'arbre éversé (vert, flèche en pointillés). gII Le connecteur de l'arbre et du tubule (flèche) et l'arbre éversé (flèche en pointillés). gIII Paroi du tubule entièrement éversée (magenta) et les barbes (vert). magenta, flèche pointillée) peu décoré de barbes (vert, flèche).

Hydra spinaline est une protéine riche en glycine et en histidine présente dans les structures de la colonne vertébrale à la surface de la tige des nématocystes Hydra51,52. Pour tester le rôle des barbillons empilés au centre dans l'éversion des tubules chez Nematostella, nous avons utilisé le shRNA53,54 pour renverser v1g243188, précédemment signalé comme étant un gène spécifique aux nématocytes codant pour un produit de type spinaline55. Cependant, une analyse plus approfondie suggère que v1g243188 code pour un facteur de type fibroïne assez éloigné dans la composition de la séquence de la spinaline d'Hydra51,52, et les orthologues directs de la spinaline d'Hydra n'ont pas été identifiés chez Nematostella49. Néanmoins, nous avons constaté que le renversement de v1g243188 entraînait des filaments d'arbre plus minces et faiblement marqués et, dans certains cas, perturbait visiblement la structure des barbes. La perte d'intensité TRITC a indiqué qu'une fraction du colorant était également incorporée dans la structure de l'arbre, directement ou indirectement en raison de la présence de v1g243188. Bien que le renversement ait perturbé la structure des barbes et leur disposition (Fig. 3e, flèches), cela n'a pas semblé affecter le fonctionnement du fil. Cependant, la perte de v1g243188 a entraîné une flexion accrue du tubule par rapport aux témoins (Fig. 3e, flèche en pointillé). Cette observation suggère que v1g243188 est un composant du thread qui joue un rôle dans son intégrité structurelle mais pas dans son fonctionnement. De plus, nous avons noté que la disposition hélicoïdale stéréotypée des barbes et leurs configurations empilées étaient perturbées dans les échantillons présentant les phénotypes les plus forts (Fig. 3f, flèche, Fig. 6a supplémentaire, encadrés). La mesure de l'intensité TRITC des structures de l'arbre dans les fils déchargés a indiqué que l'incorporation de TRITC avait été réduite après le renversement de v1g243188, avec une réduction d'environ 65% des niveaux d'ARNm (Fig. 6d, e supplémentaire). Dans les nématocystes déchargés, le fil entièrement éversé semblait être un tube isodiamétrique composé d'une paroi marquée WGA équipée de barbes et de filaments de tige marqués TRITC, à l'exclusion des régions de connecteur (Fig. 3g, cases en pointillés). Les barbes ont diminué en densité de l'extrémité proximale à l'extrémité distale du tubule et ont peu décoré la région distale (Fig. 3gII – gIV). Nous émettons l'hypothèse que les barbes, empilées à l'intérieur avant l'éversion et distribuées de manière hélicoïdale à l'extérieur après l'éversion, pourraient fonctionner comme un squelette qui empêche davantage de flexion et de vrillage pour le tubule allongé. En effet, au fur et à mesure que les barbes diminuaient distalement, le tubule semblait devenir plus enclin au vrillage par rapport aux régions proximales qui pouvaient se plier en courbes lisses (Fig. 3g, flèche). Fait intéressant, dans l'imagerie en direct d'un fil d'allongement, nous avons observé que le tubule effectuait des virages lisses à 180 ° dans sa région proximale dense de barbe (Supplémentaire Film 10). Dans l'ensemble, nos données indiquent que l'éversion du tubule implique le déploiement de la paroi du tubule dans lequel les barbes fournissent probablement un support structurel pour le fil d'allongement.

Ces résultats nous ont permis de construire un modèle décrivant les principaux aspects de l'éversion géométrique observée en trois phases. Nos résultats suggèrent que les filaments de la tige sont attachés apicalement aux volets de la capsule et basalement au tubule via des régions de connecteur (Fig. 4a). Phase I : lors de la décharge, la tige est éjectée avec le connecteur capsule-tige recouvrant la tige d'éjection. Une structure à double paroi est formée (Fig. 4b, c). Sur la base d'images fixes et de films, l'éversion de l'arbre se produit après l'éjection complète de l'arbre. Ainsi, nous postulons que le connecteur accumule une contrainte élastique maximale lorsque la tige éjectée atteint sa distance maximale de la capsule (Fig. 4c). Phase II : la contrainte élastique sur le connecteur capsule-arbre crée des forces vers l'extérieur appliquées au sommet des filaments de l'arbre comprimé, entraînant le détachement des filaments et l'initiation du processus d'éversion en raison de la libération de la contrainte élastique à l'intérieur de l'arbre (Fig. 4d – g, initiation). À la fin de la séquence, une lumière est formée à l'intérieur de la tige qui est protégée par les filaments épais (Fig. 4h, fin de la phase II). Phase III : La phase finale commence par la libération du connecteur diaphysaire-tubule qui se retourne en se repliant sur lui-même pour former une structure à double paroi (Fig. 4i). Le segment non éversé du tubule sort alors progressivement de la capsule et se déplace à travers la partie éversée du fil allongé (Fig. 4j).

La boîte indique les sous-structures du nématocyste. Panneaux inférieurs : vues agrandies des régions critiques au cours de phases distinctes. une capsule non déchargée avec un arbre étroitement enroulé entouré par la paroi de l'arbre, deux connecteurs et le tubule enroulé. b, c Étape initiale de la décharge du puits (Phase I). Le mouvement vers l'avant et l'éversion du connecteur capsule-arbre (CS) renfermant les filaments de l'arbre éjecté sont illustrés. Les flèches indiquent le mouvement vers l'avant de l'arbre. d–h Le mécanisme d'éversion géométrique de l'arbre et le déroulement des filaments comprimés de l'arbre (Phase II). Les flèches indiquent la direction des forces appliquées au sommet des filaments de l'arbre comprimé. e–g Étapes de la progression de l'éversion de la tige. Le modèle montre les filaments de l'arbre qui se déroulent et le mouvement vers l'avant du connecteur arbre-tubule et du tubule. h L'étape finale de l'éversion de l'arbre. Remarque : L'extrémité basale de la tige non inversée devient l'extrémité apicale de la tige éversée. i–j Le mécanisme d'éversion du connecteur diaphysaire-tubule et du tubule (Phase 3).

Dans cet article, nous avons décrit l'organisation 3D du nématocyste et la séquence des transformations géométriques qui se produisent lors de son activation. Nous proposons également un modèle expliquant les mécanismes spécifiques de l'éversion des threads. Sur la base de nos résultats, nous concluons que le fonctionnement du nématocyste se produit en trois étapes impliquant une transformation complexe de l'arbre et l'allongement du tubule, au cours de laquelle l'énergie stockée dans la structure globale est transformée en énergie cinétique. L'arbre remplit deux fonctions essentielles : d'abord comme une seringue comprimée pour pénétrer la cuticule cible ; seconde comme un tunnel protecteur pour le passage du tubule mince.

La structure de la tige des nématocystes anthozoaires présente une structure lamellaire décalée qui diffère des sténoteles spécialisées d'Hydra qui présentent un stylet colocalisé en forme de pointe de flèche3,17,56,57. Godknecht et Tardent ont précédemment suggéré que la disposition échelonnée des lamelles comme on le voit dans les tiges des nématocystes d'Anemonia Sulcata entraîne un impact "ressemblant à un marteau perforateur" sur une petite zone de la cible pendant l'éversion17. Chez les sténoteles d'Hydra, la pointe du stylet impacte et perce la cible en un seul point2,3,11. Ainsi, la cinétique de décharge dans les sténoteles d'Hydra est de plusieurs ordres de grandeur plus rapide que le processus plus lent d'éversion de la tige que nous avons observé dans les nématocystes de Nematostella11,12.

Le processus d'éversion de l'arbre ressemble à la mécanique d'une fronde en forme de Y dans laquelle l'énergie élastique est stockée dans deux bandes attachées à un tampon contenant un projectile. Lors du relâchement du tampon, les bandes étirées subissent une éversion géométrique. L'énergie élastique stockée dans les bandes se transforme en énergie cinétique du projectile en accélération. Les nématocystes utilisent une approche similaire, mais en raison de l'espace limité à l'intérieur de la capsule, stockent l'énergie élastique nécessaire à l'éversion de la tige en pliant et en tordant trois filaments et en les attachant à la capsule et au tubule. Les hélices des filaments retournés présentent un rayon et un pas plus grands par rapport à leur configuration non inversée. Ainsi, la quantité d'énergie élastique stockée dans les bobines hélicoïdales diminue à l'état retourné. L'énergie excédentaire libérée lors de l'éversion de l'arbre est éventuellement utilisée pour la libération du connecteur arbre-tubule (Note complémentaire 1, Fig. 7 supplémentaire). Les connecteurs pourraient fonctionner dans l'initiation de l'éversion ; l'étirement du connecteur capsule-arbre utilise l'énergie de la décharge pour initier l'éversion de l'arbre, tandis que le connecteur arbre-tubule transfère l'énergie élastique de la "fronde" pour initier l'éversion du tubule. Le connecteur tige lâche-tubule forme rapidement un tube cylindrique qui pourrait servir de zone tampon pour la transition de la tige à trois filaments vers le tubule torsadé.

La source de la force motrice pour la pénétration des tubules pourrait s'expliquer par la pression osmotique et les forces élastiques accumulées dans la structure des tubules. Il a été démontré que l'hydratation des capsules rompues entraîne l'extrusion et la détorsion du tubule sans subir d'éversion, ce qui suggère que le tubule torsadé stocke de l'énergie élastique pour être ensuite transférée en énergie cinétique en agissant comme un ressort qui est libéré par relaxation à un état cylindrique19,20. La structure à double paroi observée lors de la relaxation (Fig. 3d, deuxième panneau, flèche) permet probablement l'écoulement de la matrice PG de la capsule dans la lumière, rechargeant les forces qui poussent le tubule vers l'avant20. Le processus est répété jusqu'à ce que le tubule soit complètement allongé ou atteigne un obstacle (Films supplémentaires 10, 11). En résumé, cette étude démontre la capacité opérationnelle du nématocyste en tant que micromachine biologique complexe et auto-assemblée. Nous proposons que ces organites anciennes et sophistiquées représentent un modèle idéal pour les dispositifs à micro-échelle d'inspiration biologique qui pourraient être utilisés dans diverses applications allant de la technologie médicale à la science des matériaux.

Les animaux ont été élevés à 23 ° C dans de l'eau de mer artificielle à 12 parties pour mille (ppt) (ASW; Sea Salt; Instant Ocean). L'induction du frai et le dégel ont été effectués comme décrit précédemment58. Les embryons et les polypes ont été cultivés à température ambiante 23°C ou 25°C.

La lignée rapporteur transgénique a été générée par l'insertion médiée par une méganucléase d'un plasmide contenant de l'EGFP sous le contrôle d'un promoteur de nématogalectine de N. vectensis spécifique aux nématocytes59,60. Cette construction a été générée dans le cadre d'un système à double rapporteur qui héberge un journaliste neuronal mScarlet-I qui n'a pas été analysé ici et sera décrit dans une publication à venir.

Des Nematostella vectensis planulae vivantes (2 dpf) ont été mises à réagir avec le dérivé de rhodamine réactif aux amines 5/6-tétraméthyl-rhodamine-6-isothiocyanate, TRITC (Cayman Chemical, n° 19593) pendant une courte durée (30 min à 1 h). Les animaux ont été incubés pendant 1 h à une concentration finale de 1 μM pour l'imagerie en direct de la décharge. Pour les spécimens fixes, le TRITC à une finale de 25 μM est incubé pendant 1 h avec des larves 2dpf. Le colorant fluorescent a coloré les animaux sans aucune toxicité apparente jusqu'à la concentration de 25 μM testée dans cette étude. Lors de l'incubation, le colorant réactif a été éliminé par plusieurs lavages. Les animaux ont été transférés dans des plats propres dans un milieu sans colorant pendant 3 à 5 jours jusqu'à ce que les nématocytes matures émergent et que la fluorescence de fond non spécifique disparaisse considérablement. Des solutions mères de 25 mM de TRITC ont été préparées et stockées congelées à -20 ° C et utilisées sans réduction observable de la réactivité chimique.

Pour la microscopie électronique à balayage (SEM) de la topographie (Fig. 3a), les échantillons ont été traités conformément aux rapports précédents61. En bref, les échantillons ont été fixés dans du glutaraldéhyde à 2, 5% et du paraformaldéhyde à 2% dans un tampon NaCacodylate 0, 1 M et colorés avec de l'acide tannique aqueux, du tétroxyde d'osmium, du thiocarbodrazide, puis à nouveau du tétroxyde d'osmium (TOTO). Les échantillons ont été déshydratés dans une série graduée d'éthanol et séchés au point critique dans un séchoir à point critique Tousimis Samdri 795, montés sur des talons et imagés dans un SEM de table Hitachi TM4000 à 15 kV avec détecteur BSE. Pour la microscopie électronique (EM) de l'ultrastructure interne, les échantillons ont été fixés comme ci-dessus, avec une fixation secondaire dans du tétroxyde d'osmium tamponné à 1 % pendant 1 h et une coloration en bloc dans de l'acétate d'uranyle aqueux à 0,5 % effectuée pendant la nuit à 4 °C. Une série graduée d'éthanol a été utilisée pour la déshydratation avec de l'acétone comme solvant de transition et l'infiltration dans la résine Hard Plus (Electron Microscopy Sciences). Les échantillons ont été durcis pendant 48 h à 60 ° C et des coupes en série ont été coupées à 50 nm à l'aide d'un couteau ultra-diamant Diatome 45 degrés ou d'un couteau diamant AT-4 35 degrés sur un ultramicrotome Leica UC7. Les sections ont été recueillies sur des grilles à fentes pour l'imagerie STEM et un substrat plat (lamelle ou puce de silicium) pour l'imagerie SEM, et post-colorées à l'aide d'acétate d'uranyle à 4 % dans du méthanol à 70 % pendant 4 min et de la triple tache de plomb de Sato pendant 5 minutes. Les sections sur un substrat plat ont été montées sur des talons, le dessous de la lamelle recouverte de peinture argentée pour atténuer la charge, et toutes ont été recouvertes de carbone 4 nm dans une coucheuse Leica ACE600. Les sections ont été imagées dans un Zeiss Merlin SEM en utilisant le détecteur aSTEM ou 4QBSD, SmartSEM (6.0.0, Zeiss) et le logiciel Atlas 5.2.2.15 (Fibics, Inc.). Les images en série ont été alignées et tracées pour la modélisation 3D dans IMOD (4.9.10)62 et les modèles 3D rendus dans Blender 2.92 (Blender Foundation). Le redressement des nématocytes complètement déchargés (Fig. 2e) a été effectué aux Fidji (ImageJ)63. L'image composite de la capsule entière du nématocyste (Fig. 1d) et la fausse coloration ont été réalisées dans Photoshop 2021 (Adobe, Inc.).

Les nématocystes des animaux traités au TRITC ont été éliminés en diminuant le pH du milieu à l'aide d'acide acétique. Les nématocystes se déchargent in vivo lorsque le milieu devient acide. Les polypes primaires ont été immobilisés dans des plats à fond de verre en les prenant en sandwich entre une lame de verre et le fond d'un plat à fond de verre à l'aide d'un scellant à base de silicone. Les images capturées après addition goutte à goutte d'acide acétique glacial (37%) à l'ASW qui déclenche la décharge de la capsule lorsque le pH diminue suffisamment dans le milieu en dessous d'un certain seuil. L'imagerie en direct des événements de maturation et de décharge des nématocystes a été enregistrée avec le système de disque rotatif Yokogawa CSU-w1 sur une plate-forme Nikon Ti2 avec un objectif 100 ×.

Les polypes primaires traités au TRITC ont été fixés dans le fixateur de Lavdovski (éthanol∶formaldéhyde∶acide acétique∶dH2O ; 50∶10∶4∶36) pendant la nuit24. Le fixateur a été retiré et les échantillons ont été lavés 5 fois avec 1 ml de PBS pH 7,4 pour éliminer le fixateur. Les échantillons ont été perméabilisés avec du Triton-X100 à 0,1 % dans du PBS, pH 7,4 pendant 15 min. Après plusieurs lavages supplémentaires dans du PBST (0,1 % de Tween 20 dans du PBS, pH 7,4), les polypes ont d'abord été bloqués pendant 1 h et incubés pendant la nuit à 4 °C avec du NvNCol-4 (1 : 500) dans du PBST additionné de 10 % de sérum de chèvre. Minicollagène et Ncol424 L'anticorps anti-NvNcol-4 dirigé contre la protéine NvNcol-4 du minicollagène de Nematostella vectensis (lapin, dilution 1:500) était un aimable cadeau de Suat Ozbek, Université de Heidelberg). Les polypes ont été lavés trois fois dans du PBST additionné de 10 % de sérum de chèvre et incubés avec l'anticorps secondaire anti-lapin couplé Alexa Fluor 647 (IgG anti-lapin de chèvre (H+L), dilution 1:500, Thermo Fisher, Cat. #: A21245, Lot: 1981173) et WGA-OregonGreen (dilution 1:500, Invitrogen Cat. #: W7024B, Lot: 2 298084) pendant une nuit dans du PBST additionné de 10 % de sérum de chèvre. Ensuite, les polypes ont été lavés plusieurs fois dans du PBS et incubés dans du PBS à 90 %/glycérol pendant une nuit. Les polypes ont été transférés sur une lame de verre et montés sur une lame de verre avec un milieu de montage antifade ProLong Glass (ThermoFisher, Cat. #: P36982). Les images de fluorescence ont été acquises à l'aide de Yokogawa CSU-w1 sur une plate-forme Nikon Ti2. Les images confocales de fluorescence à super résolution ont été acquises à l'aide du Zeiss LSM780 en mode Airyscan.

Sur la figure 2f, les polypes primaires traités au TRITC ont été fixés dans le fixateur de Lavdovski (éthanol∶formaldéhyde∶acide acétique∶dH2O ; 50∶10∶4∶36) pendant la nuit24,25. Après plusieurs lavages, les polypes ont été transférés dans du PBS/Glycérol (PBS) et incubés pendant une nuit. Les polypes ont été transférés sur une lame de verre et montés avec ProLong Glass Antifade Mountant (ThermoFisher, Cat. #: P36982). Les polypes ont été étalés sur les lames de verre. Les tentacules marqués avec des nématocystes partiellement déchargés ont été imagés intacts ou écrasés avec la lame de couverture pour détacher les capsules du tissu. L'imagerie de fluorescence a été réalisée à l'aide du Zeiss LSM780 en mode Airyscan.

Les polypes primaires traités au TRITC ont été congelés dans de l'azote liquide, décongelés et macérés manuellement avec un pilon en plastique. Les échantillons ont été mis en suspension dans 1 ml de Percoll (50 %, v/v ; Sigma Cat. # : P1644) dans 300 mM de saccharose additionné de 0,01 % de Tween20 pour empêcher l'adhérence aux tubes de microcentrifugeuse. Le tissu est encore perturbé par pipetage de haut en bas. Le mélange est laissé reposer sur de la glace pendant 30 min et centrifugé pendant 15 min à 950 g. Le culot est lavé deux fois avec du PBS avec 0,01 % de Tween-20) remis en suspension dans du tampon de décharge de nématocystes (Tris 10 mM, pH 7,5, CaCl2 10 mM). La décharge a été initiée par l'ajout de 1 mM de DTT et incubée pendant 30 min. Après incubation pendant 30 min, 1 μg/ml d'agglutinine de germe de blé conjuguée à OregonGreen (dilution 1:500, Invitrogen, Cat. # W7024B, Lot : 2298084) a été ajouté au tube et incubé pendant 1 h. Les échantillons colorés ont été lavés deux fois avec du PBST et centrifugés à 1000 × g pendant 5 min. Une pastille lâche est vue et mise en suspension dans du PBST. Des aliquotes de 5 μl ont été étalées sur des lames de verre et montées avec ProLong Glass Antifade Mountant. Les images ont été acquises à l'aide du système de disque rotatif Yokogawa CSU-W1 sur une plate-forme Nikon Ti2 avec un objectif 100 ×.

L'ARN en épingle à cheveux court ciblant les gènes putatifs de Nematostella v1g243188 et Nemve1_232014 a été synthétisé par réaction de polymérase T7, purifié à l'aide du kit Direct-zol RNA miniprep Plus (Zymo Research, Cat. #: R2072). Le shRNA purifié a été microinjecté dans des œufs non fécondés à une concentration de 1 μg/μl ou électroporé à une concentration d'environ 600 ng/μl à 1 μg/μl selon les méthodes décrites précédemment53,54. Les ovules ont été fécondés avec du sperme de mâles sauvages ou transgéniques. Après fécondation, les embryons ont été incubés pendant 2 jours et traités au TRITC. Les amorces suivantes (Integrated DNA Technologies) ont été recuites et utilisées comme matrices duplex pour la synthèse d'ARN en épingle à cheveux courte :

v1g243188 Transférer : TAATACGACTCACTATAGCGGTGGACTCTACTTATTTTCAAGAGAAATAAGTAGAGTCCACCGCTT et

v1g243188 Inverser : AAGCGGTGGACTCTACTTATTTCTCTTGAAAATAAGTAGAGTCCACCGCTATAGTGAGTCGTATTA

Nemve1_232014 Avant :

TAATACGACTCACTATAGGCATCGTTACCAGTACAATTCAAGAGATTGTACTGGTAACGATGCCTT

Nemve1_232014 Inverser :

AAGGCATCGTTACCAGTACAATCTCTTGAATTGTACTGGTAACGATGCCTATAGTGAGTCGTATTA

Brouiller vers l'avant :

TAATACGACTCACTATAGCAACACGCAGAGTCGTAATTCAAGAGATTACGACTCTGCTGTGTTGCTT

Scramble inversé :

AAGCAACGCAGAGTCGTAATCTCTTGAATTACGACTCTGCGTGTTGCTATAGTGAGTCGTATTA.

Les animaux électroporés ont été dissous dans du réactif TRIzol (Ambion, réf. : 15596018 ; lot n° 254707) et l'ARN a été extrait à l'aide du kit Direct-zol RNA Mini Prep Plus (Zymo Research, n° cat. : R2072) conformément aux recommandations du fabricant. Après extraction de l'ARN, l'ADNc a été synthétisé avec le kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems, n° cat. : 43824 06, Lot # 0124432) Enfin, la qRT-PCR a été réalisée à l'aide du master mix Luna Universal qPCR (NEB, Cat. # : M3003L, Lot # : 10133023) en utilisant les amorces suivantes (Integrated DNA Technologies) :

GAPDH

Avant 5′-GGACCAAGTGCCAAGAACTG-3′

Inverser 5′-GGAATGCCATACCCGTCAG-3′

v1g243188

Transférer 5′-CCGCCTTATCCTTCGTTGAT-3′

Inverser 5′-ATGCGGTGGACTCTACTTATTG

Nemve1_232014

Avant 5′-TGTGAAGGAACGACGATGTG-3′

Inverser 5′-GACCGTTGATGATCTCGATAC-

Les données quantitatives de RT-PCR ont été analysées comme décrit précédemment64.

Toutes les analyses d'images ont été effectuées avec Fidji (ImageJ, 2.1.0/1.53c). La luminosité, le contraste et le gamma ont été ajustés manuellement. L'arrière-plan a été soustrait à l'aide de l'outil de soustraction d'arrière-plan à Fidji. Dans les Fig. 6b, c supplémentaires, la luminosité a été augmentée pour mieux visualiser la structure du fil. Les mesures de longueur des capsules et des tubules non déchargés et déchargés ont été effectuées manuellement à l'aide de l'outil de traçage manuel à main levée Fidji (ImageJ) et les résultats ont été discutés dans Informations supplémentaires. L'intensité moyenne du signal, la surface et la longueur des objets ont été acquises aux Fidji (ImageJ) à l'aide d'un outil de mesure. Les résultats ont été utilisés dans les estimations décrites dans les informations supplémentaires. Les estimations ont été faites dans Wolfram Mathematica (12.0). Dans la Fig. 4, le modèle a été créé dans Blender (2.93).

Pour les micrographies EM des Fig. 1d, e et 2b–e, des coupes en série de deux animaux différents ont été acquises. À partir de 350 capsules observées dans les volumes des deux animaux, nous avons acquis des images haute résolution de trois volumes complets de capsules non déchargées et de deux volumes partiels de capsules non déchargées ; un volume complet d'une gélule déchargée en phase 1, deux volumes complets de gélules déchargées en phase 2, et trois volumes partiels et un volume complet de gélules déchargées en phase 3.

Pour la vérification qRT-PCR du knockdown du gène cible, trois expériences de knockdown indépendantes ont été réalisées avec environ 200 polypes par échantillon. Chaque échantillon a été analysé en triple exemplaire. Des graphiques ont été générés et des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism (9.3.1). La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un test t d'étudiants non appariés à deux queues, les valeurs de p sont indiquées dans les légendes des figures. Le d de Cohen a été utilisé pour évaluer la taille de l'effet pour toutes les analyses de test t (différence moyenne entre les groupes divisée par l'écart type regroupé).

Des images de fluorescence représentatives de nématocystes partiellement déchargés ont été acquises à partir des tentacules d'animaux traités au TRITC fixés avec le réactif de Lavdovski avec des résultats identiques dans 10 expériences de marquage et de décharge indépendantes. La figure 1a est une image représentative de l'expression du transgène observée chez les animaux de six pontes indépendantes. Sur la figure 1b, le nématocyte et sa capsule étaient représentatifs des nématocytes de la colonne corporelle (n = 10 colonnes de corps polypes primaires, 5 expériences). Sur la figure 1c, les capsules étaient des images fluorescentes à fort grossissement représentatives de petits (n = 19) et grands (n = 20) basitrichs et p-mastigophores (n = 10) purifiés à partir d'environ 200 polypes primaires. La séquence d'images de la Fig. 2a et les vidéos supplémentaires 5 à 7, 10 et 11 ont été enregistrées à partir de trois expériences de décharge en direct indépendantes.

La figure 2f et la figure supplémentaire 2 étaient des images représentatives en super résolution de la tige et du tubule de fils partiellement déchargés provenant de quatre expériences indépendantes. Sur les figures 2g et h, la séquence de décharge a été reconstruite à partir des images représentatives de fils partiellement déchargés (n = 67 fils partiellement déchargés de tentacules de polypes primaires, trois expériences). La figure 3a est une image SEM représentative de fils partiellement déchargés (n = 6). La figure 3b est une image représentative de tentacules de polypes primaires colorés au WGA et au TRITC fixés avec le réactif de Lavdovski (n = 10 tentacules de polypes primaires, trois expériences). Les figures 3c, d étaient des représentants des fils de stade 1 (fig. 3c, n = 20) et des fils de stade 2 à double paroi (fig. 3d, n = 8) parmi les fils visibles sur un tentacule de polype primaire. Les figures 3e, f sont des images fluorescentes représentatives acquises à partir de tentacules de polypes primaires partiellement déchargés de shRNA de contrôle de brouillage (n = 0/25 fils de 1/27 tentacules) et v1g243188 shRNA (n = 25/25 fils de 1/25 tentacules) à partir de 5 expériences de knockdown. La figure 3g était une image représentative de fils purifiés et entièrement déchargés d'environ 300 polypes primaires (n = 15 fils).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les données sources sont fournies avec ce document. Les données originales sous-jacentes à ce manuscrit sont accessibles à partir du Stowers Original Data Repository (ODR) à l'adresse : http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1684

Les demandes de correspondance et de matériel doivent être adressées à [email protected] Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Alejandro Sánchez Alvarado, Jay Unruh, Kausik Si, Whitney Leach, Eric Hill et Subramanian Ramanathan pour leurs commentaires utiles sur le manuscrit. Nous sommes redevables à Molly Simmons pour les illustrations du modèle. Nous tenons à remercier Xia Zhao et Morgan Harwood (Electron Microscopy Core) pour l'assistance dans les expériences et le Stowers Reptiles and Aquatics Facility pour l'entretien des animaux. Nous sommes reconnaissants à Suat Ozbek, de l'Université de Heidelberg, pour l'anticorps minicollagène Ncol4 et à Ruohan Zhong pour son aide dans la génération des animaux transgéniques. Le travail a été financé par le Stowers Institute for Medical Research.

Institut Stowers pour la recherche médicale, Kansas City, MO, États-Unis

Ahmet Karabulut, Melainia McClain, Boris Rubinstein, Keith Z. Sabin, Sean A. McKinney et Matthew C. Gibson

Département d'anatomie et de biologie cellulaire, École de médecine de l'Université du Kansas, Kansas City, KS, États-Unis

Matthew C.Gibson

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AK et MCG ont conçu cette étude. AK, BR et MCG ont rédigé le manuscrit. AK, SMC, MMKZS et BR ont réalisé les expériences et analysé les données.

Correspondance à Ahmet Karabulut ou Matthew C. Gibson.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Nicholas Money et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Karabulut, A., McClain, M., Rubinstein, B. et al. L'architecture et le mécanisme de fonctionnement d'un organite urticant cnidaire. Nat Commun 13, 3494 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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Reçu : 29 septembre 2021

Accepté : 02 juin 2022

Publié: 17 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-31090-0

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