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Mar 08, 2023

Démontage de l'adaptateur mécanosensible Hic

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 7446 (2023) Citer cet article

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L'arthrose (OA) est la maladie articulaire la plus courante associée à la destruction du cartilage articulaire. La métalloprotéinase-13 matricielle (MMP-13) joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de l'arthrose par la dégradation du collagène II, un composant majeur du cartilage articulaire. Le clone 5 inductible par le peroxyde d'hydrogène (Hic-5; TGFB1I1), un mécanocapteur inductible par le facteur de croissance transformant β, a déjà été signalé comme favorisant la pathogenèse de l'arthrose en régulant à la hausse l'expression de MMP-13 dans les lésions arthrosiques de la souris. Dans notre étude actuelle, l'analyse immunohistochimique a montré que l'expression de la protéine Hic-5 était augmentée dans le cartilage OA humain par rapport au cartilage normal. Des expériences fonctionnelles ont démontré que l'expression de Hic-5 et de MMP-13 était augmentée par le stress mécanique et que l'expression de MMP-13 induite par le stress mécanique était supprimée par l'ARNsi de Hic-5 dans les chondrocytes humains. De plus, la localisation intracellulaire de Hic-5 s'est déplacée vers le noyau à partir d'adhérences focales dans les chondrocytes humains soumis à un stress mécanique, et le Hic-5 nucléaire a augmenté l'expression du gène MMP-13. In vivo, l'injection intra-articulaire d'ARNsi Hic-5 a diminué le score international de l'Osteoarthritis Research Society et l'expression de la protéine MMP-13 dans le cartilage articulaire des rats OA. Nos résultats suggèrent que Hic-5 régule la transcription de MMP-13 dans les chondrocytes humains, et Hic-5 peut être une nouvelle cible thérapeutique pour l'arthrose car la progression de l'arthrose a été supprimée par l'injection intra-articulaire d'ARNsi Hic-5 chez le rat.

L'arthrose (OA) est le trouble articulaire le plus répandu caractérisé par la dégradation du cartilage articulaire. Un grand nombre d'études ont révélé que de multiples facteurs de risque contribuent au développement de l'arthrose, notamment l'obésité, la prédisposition génétique, le vieillissement, les traumatismes, l'inflammation et le stress mécanique excessif1,2,3,4. Des expériences in vitro antérieures utilisant des systèmes d'étirement cellulaire ont montré qu'un stress mécanique excessif induit l'expression de la métalloprotéinase matricielle-13 (MMP-13) qui joue un rôle essentiel dans la pathogenèse de l'arthrose par la dégradation du collagène II, un composant majeur du cartilage articulaire5,6, 7. L'inactivation de la MMP-13 chez la souris protège contre la dégradation du cartilage causée par l'induction chirurgicale par rapport aux souris de type sauvage (WT)8. Inversement, les souris transgéniques avec MMP-13 constitutivement active exprimée spécifiquement dans le cartilage présentent une érosion du cartilage articulaire similaire à l'OA9 humaine.

Le clone-5 inductible par le peroxyde d'hydrogène (Hic-5) est une protéine d'échafaudage isolée en tant que gène induit par le peroxyde d'hydrogène et le facteur de croissance transformant β (TGF-β)10. Nous avons précédemment démontré que la localisation subcellulaire de Hic-5 passe des adhérences focales aux fibres d'actine de stress en réponse au stress mécanique et Hic-5 contrôle la capacité contractile de la cellule11. En outre, Hic-5 a été signalé comme étant impliqué dans la pathogenèse de divers troubles. Notre étude précédente a montré que Hic-5 augmente la MMP-2 activée en régulant l'expression de la MMP membranaire de type 1, ce qui conduit à la formation d'anévrismes et de rupture de l'aorte abdominale12. Dans les tumeurs du sein, le Hic-5 est nécessaire au dépôt de la matrice extracellulaire (ECM) et à la contractilité cellulaire, et les métastases pulmonaires diminuent chez les souris déficientes en Hic-513. Bien qu'il existe des différences dans les mécanismes détaillés de l'implication de Hic-5 dans ces troubles, le remodelage de la MEC est un mécanisme courant.

Récemment, nous avons découvert que l'expression de Hic-5 augmentait dans le cartilage articulaire de la souris au début du développement de l'arthrose, et que les souris dépourvues de Hic-5 avaient significativement moins d'érosion du cartilage que les souris WT14. Des expériences in vitro utilisant des chondrocytes murins ont également démontré que le déficit en Hic-5 diminue l'expression de MMP-13 induite par un stress mécanique excessif. Cette étude visait à déterminer si Hic-5 est impliqué dans l'expression de MMP-13 induite par un stress mécanique excessif dans les chondrocytes humains, et à étudier l'efficacité de Hic-5 en tant que cible thérapeutique pour l'arthrose in vivo.

Pour explorer le rôle de Hic-5 dans la pathogenèse de l'arthrose humaine, nous avons d'abord examiné l'expression de Hic-5 dans le cartilage arthrosique humain. L'immunohistochimie a montré que l'expression de Hic-5 était plus élevée dans le cartilage OA que dans le cartilage normal (Fig. 1A, B) et que le nombre de cellules positives pour Hic-5 était significativement augmenté dans le cartilage OA (Fig. 1C). Ces résultats étaient cohérents avec notre rapport précédent indiquant que Hic-5 était fortement exprimé dans le cartilage de souris avec OA14 induit chirurgicalement.

Induction de l'expression du clone-5 (Hic-5) inductible par le peroxyde d'hydrogène dans le cartilage de l'arthrose humaine (OA). (A, B) Coloration immunohistochimique représentative de Hic-5 dans le cartilage normal et OA. Les lignes brisées indiquent la surface du cartilage articulaire. Grossissement d'origine × 100 po (A) ; × 400 po (B). Barre = 100 µm. (C) Quantification des cellules Hic-5-positives dans le cartilage normal (n = 3) et OA (n = 3). Les données ont été analysées par le test t non apparié. Les valeurs sont la moyenne ± SEM. **P < 0,01.

Dans l'étude précédente, nous avons démontré que l'expression de Hic-5 et de MMP-13 dans les chondrocytes articulaires de souris était augmentée par un stress mécanique excessif14. Par conséquent, nous avons recherché si les chondrocytes articulaires humains avaient également une expression accrue de Hic-5 et de MMP-13 induite par un stress mécanique en plus d'autres MMP et d'un inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase matricielle-1 (TIMP-1). En conséquence, les niveaux d'ARNm de Hic-5, MMP-3 et MMP-13 ont augmenté dans les chondrocytes humains stimulés par un stress mécanique par rapport aux chondrocytes non stimulés (Fig. 2A). L'expression de MMP-1 avait tendance à être régulée positivement par le stress mécanique, mais la différence n'était pas significative et il n'y avait aucun effet du stress mécanique sur l'expression de MMP-2 ou de TIMP-1. Ensuite, nous avons examiné l'effet de l'inactivation de Hic-5 sur l'expression du gène MMP en utilisant le petit ARN interférent Hic-5 (ARNsi) et l'ARNsi de contrôle comme contrôle négatif. Bien que l'inactivation de Hic-5 par l'ARNsi n'ait pas modifié l'expression de MMP-13 sans stress mécanique, l'expression de MMP-13 induite par le stress mécanique a été significativement réduite par l'ARNsi Hic-5 par rapport à l'ARNsi témoin. Cependant, l'ARNsi Hic-5 n'a eu aucun effet sur l'expression de MMP-1 ou MMP-3 (Fig. 2B). Ces résultats étaient similaires à nos résultats précédents observés dans des chondrocytes isolés de souris knock-out Hic-5, indiquant que Hic-5 régulait spécifiquement l'expression du gène MMP-13 parmi d'autres MMP sous contrainte mécanique.

Atténuation de l'expression de la métalloprotéinase matricielle induite par le stress mécanique (MMP-13) par knockdown de Hic-5 dans les chondrocytes humains. (A) niveaux d'ARNm de Hic-5, MMP et inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase matricielle-1 (TIMP-1) dans les chondrocytes humains exposés à un stress mécanique (MS +) pendant 30 min ou non traités (MS-). Les cellules ont été recueillies à 1 h après le stress mécanique. (n = 8 répétitions biologiques). (B) Modifications de l'expression génique en réponse à l'inactivation de Hic-5 dans les chondrocytes humains avec ou sans stress mécanique. Des chondrocytes humains ont été traités avec du siRNA Hic-5 (10 nM) ou du siRNA contrôle (10 nM) pendant 24 h avant stimulation par stress mécanique. (n = 4 répétitions biologiques). Les niveaux relatifs d'ARNm ont été déterminés par transcription inverse quantitative-amplification en chaîne par polymérase. Les valeurs sont la moyenne ± SEM. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; §P = 0,0572 par le test t non apparié en (A) ou l'analyse de variance unidirectionnelle avec le test de Tukey pour les comparaisons multiples en (B).

Nous avons ensuite observé la localisation intracellulaire de Hic-5 dans les chondrocytes humains avec ou sans stress mécanique. Hic-5 a été détecté au niveau des adhérences focales dans des conditions non stimulées, tandis que l'expression de Hic-5 dans les adhérences focales a été atténuée après 0, 5 Hz, 10% de charge de traction cyclique pendant 30 min (Fig. 3A). De plus, la coloration Hic-5 était prédominante dans le noyau après une charge de traction cyclique pendant 3 h (Fig. 3A). Hic-5 fait normalement la navette entre les adhérences focales et le noyau via un signal d'exportation nucléaire (NES)15. Considérant la possibilité que le stress mécanique accélère la vitesse de la navette, nous avons examiné les changements dans la localisation subcellulaire de Hic-5 après une contrainte de traction cyclique sous traitement avec la leptomycine B (LMB), un inhibiteur du NES. L'intensité du signal dans le noyau a été légèrement augmentée par LMB 1 h après le traitement, alors que l'ajout d'un stress mécanique pendant 1 h et de LMB a clairement induit la localisation nucléaire de Hic-5 dans les chondrocytes humains (Fig. 3B). Notre étude précédente a rapporté que Hic-5 accumulé dans le noyau en réponse à H2O2 participe au contrôle transcriptionnel de c-fos15. Prises ensemble, ces données impliquent que la translocation de Hic-5 des adhérences focales au noyau causée par la force mécanique a régulé l'expression de MMP-13.

Localisation subcellulaire de Hic-5 dans les chondrocytes humains stimulés par un stress mécanique. (A) Localisation intracellulaire de Hic-5 dans des chondrocytes humains exposés à un stress mécanique (MS+) pendant 30 min ou 3 h, ou non traités (MS-). Les têtes de flèche indiquent les adhérences focales. (B) Imagerie par immunofluorescence du Hic-5 nucléaire dans les chondrocytes humains après un stress mécanique. Des chondrocytes humains ont été exposés à 10 ng/ml de leptomycine B (LMB) et à un stress mécanique pendant 1 h. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). L'image représentative a été sélectionnée à partir de 3 répétitions biologiques. Grossissement d'origine : × 400. Barre = 50 μm.

Pour déterminer si l'expression de MMP-13 a été induite par Hic-5 localisé dans le noyau dans les chondrocytes humains, nous avons exprimé de force Hic-5 dans le noyau à l'aide d'un vecteur d'expression Hic-5 conjugué au signal de localisation nucléaire (NLS) (NLS-HA-hic -5). NLS-HA-Hic-5 a augmenté le niveau d'ARNm de MMP-13 dans les chondrocytes humains de manière dose-dépendante (Fig. 4A). De même, l'analyse par Western blot et la double coloration par immunofluorescence de Hic-5 et MMP-13 ont montré que la protéine MMP-13 était augmentée dans les chondrocytes exprimant NLS-HA-hic-5 par rapport aux chondrocytes non transfectés (Fig. 4B, C).

Régulation à la hausse de l'expression de MMP-13 par le Hic-5 nucléaire dans les chondrocytes humains. (A) Induction de MMP-13 dans des chondrocytes humains exprimant de manière exogène Hic-5 étiqueté avec un signal de localisation nucléaire (NLS-HA-Hic-5). Des chondrocytes humains ont été transfectés avec le vecteur d'expression NLS-HA-Hic-5 aux concentrations indiquées sur le graphique pendant 24 h. L'expression de Hic-5 et MMP-13 a été mesurée par réaction en chaîne par polymérase quantitative (n = 3 réplicats biologiques). (B) Western blot de MMP-13 dans des chondrocytes humains transfectés avec ou sans 0,2 µg de NLS-Hic-5 (n = 3 répétitions biologiques). Les valeurs sont la moyenne ± SEM. ** P < 0,01 par le test de Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaisons multiples de Dunn en (A) ou du test t non apparié en (B). Les images de transfert Western ont été recadrées et les transferts de pleine longueur sont inclus dans la Fig. 1 supplémentaire. (C) Double coloration par immunofluorescence de Hic-5 (vert) et MMP-13 (rouge) dans des chondrocytes humains transfectés avec ou sans NLS-HA- Hic-5. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). L'image représentative a été sélectionnée à partir de 3 répétitions biologiques. Grossissement d'origine : × 400. Barre = 50 μm.

Nous avons évalué le potentiel thérapeutique de Hic-5 dans le développement de l'arthrose à l'aide d'un modèle chirurgical d'arthrose chez le rat. Tout d'abord, nous avons conçu le siRNA Hic-5 de rat et validé l'effet dans les lignées cellulaires de rat JTC-19 et RAT-2. L'expression de Hic-5 a été remarquablement supprimée dans les cellules exprimant l'ARNsi Hic-5 par rapport au témoin (Fig. 5A). Ensuite, l'ARNsi Hic-5 a été injecté dans les espaces intra-articulaires des articulations du genou du rat tous les 3 jours du jour 10 au jour 19 après la méniscectomie médiale (MMx) (Fig. 5B).

Effet in vivo du renversement de Hic-5 sur l'arthrose dans le modèle de méniscectomie médiale (MMx) chez le rat. (A) Niveaux d'ARNm de Hic-5 dans des lignées cellulaires de rat transfectées avec de l'ARNsi Hic-5 (n = 5 réplicats biologiques). Les valeurs sont la moyenne ± SEM. **P < 0,01, par analyse de variance unidirectionnelle avec le test de Tukey pour les comparaisons multiples. (B) Chronologie de la procédure chirurgicale d'induction et de traitement de l'arthrose par injection intra-articulaire d'ARNsi. 10 jours après la chirurgie, les rats ont été sacrifiés pour vérifier l'induction de l'arthrose (jour 10) (n = 3). Les siRNA Hic-5 (n = 8) ou de l'eau sans nucléase comme véhicule (n = 8) ont été administrés dans les espaces intra-articulaires des articulations du genou à 10, 13 et 16 jours après la chirurgie (3 injections au total) et non traités les rats étaient le contrôle (n = 3). (C) Coloration représentative à la safranine-O du cartilage tibial chez des rats soumis à MMx. Les panneaux de droite montrent des vues à plus fort grossissement des zones encadrées dans les panneaux de gauche. Grossissement d'origine × 40 dans les panneaux de gauche, barre = 500 µm ; × 100 dans les panneaux de droite, Bar = 200 μm. (D) OA Research Society International (OARSI) score de dégradation du cartilage dans les groupes indiqués. Les lignes représentent la médiane. *P < 0,05, par le test de Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaisons multiples de Dunn.

L'analyse histologique a montré que la formation de lésions d'arthrose s'était déjà produite 10 jours après l'opération. Au jour 19, soit 9 jours après le début de l'injection d'ARNsi, le groupe de rats ayant reçu l'injection d'ARNsi a montré une progression inhibée de l'arthrose et des scores OARSI (Osteoarthritis Research Society International) inférieurs à ceux du groupe véhicule (Fig. 5C, D et tableau supplémentaire 2) . De plus, l'immunohistochimie a confirmé une diminution de l'expression de Hic-5 et de MMP-13 dans le cartilage du genou du groupe avec injection d'ARNsi par rapport aux groupes sans injection d'ARNsi, y compris les groupes au jour 10, non traités et véhicules (Fig. 6A – D). Pris ensemble, ces résultats ont indiqué que Hic-5 induit par un stress mécanique excessif améliorait le développement de l'OA en augmentant la transcription de MMP-13 (Fig. 6E).

Suppression in vivo de l'expression protéique induite par MMx de Hic-5 et MMP-13 par injection intra-articulaire d'ARNsi Hic-5 chez des rats. (A, B) Immunofluorescence représentative de Hic-5 (A, vert) et MMP-13 (B, vert) dans le cartilage tibial opéré par MMx avec injection intra-articulaire de siRNA Hic-5 (n = 8) ou véhicule (n = 8), ou cartilage tibial opéré par MMx sans traitement (jour 10, n = 3 et non traité 19 jours après MMx, n = 3). La phalloïdine (rouge) a été utilisée pour compter les cellules totales. Grossissement d'origine × 200, barre = 100 µm. (C, D) Taux de cellules positives pour Hic-5 (C) et de cellules positives pour MMP-13 (D) dans le cartilage tibial de rats. Les valeurs sont la moyenne ± SEM. *P < 0,05 ; **P < 0,01, par analyse de variance unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey. (E) Modèle schématique montrant qu'un stress mécanique excessif induit l'expression de MMP-13 via Hic-5, ce qui entraîne le développement de l'arthrose.

L'étude actuelle caractérise Hic-5 comme un régulateur majeur du développement de l'arthrose en favorisant la dégradation du cartilage. Il y avait une augmentation significative de l'expression de Hic-5 dans le cartilage OA humain, mais pas dans le cartilage non OA. Des expériences in vitro ont montré qu'un stress mécanique excessif induisait l'expression de Hic-5 et de MMP-13 dans les chondrocytes humains, et que l'inactivation de Hic-5 supprimait l'expression élevée de MMP-13, la principale enzyme dégradant l'ECM dans la formation d'arthrose. De plus, un stress mécanique excessif a altéré la localisation subcellulaire de Hic-5 des adhérences focales au noyau, et l'accumulation nucléaire de Hic-5 a entraîné la régulation transcriptionnelle de MMP-13. Des expériences in vivo ont montré que l'administration intra-articulaire d'ARNsi Hic-5 réduisait l'expression de MMP-13 et avait un effet protecteur contre la dégradation du cartilage chez des rats modèles OA. Pris ensemble, ces résultats indiquent que Hic-5 pourrait être une cible thérapeutique prometteuse pour l'arthrose.

Hic-5 est impliqué dans la pathogenèse de divers troubles, tels que la fibrose hépatique, la fibrose pancréatique et le cancer colorectal, grâce à sa fonction d'échafaudage pour plusieurs signaux cellulaires et de régulateur de l'expression des gènes liés à la MEC16,17,18. Nous avons précédemment signalé que l'expression de Hic-5 était plus élevée chez les patients atteints de ces troubles que chez les témoins sains. Dans la fibrose hépatique et pancréatique, Hic-5 agit comme un échafaudage pour la voie TGF-β/Smad2 et sa déficience atténue de manière significative la fibrose hépatique et pancréatique de souris par une réduction de la production de collagène, qui est le principal composant de la MEC dans la fibrose16,17. De plus, nous avons démontré que la surexpression de Hic-5 à l'aide d'un vecteur adénoviral dans des fibroblastes humains normaux augmentait l'expression de la lysyl oxydase (LOX) qui augmente la rigidité de la MEC et améliore la progression tumorale18. Encore plus intrigant, l'incidence des tumeurs colorectales induites par l'azoxyméthane a été supprimée chez les souris déficientes en Hic-5 par rapport aux souris WT. Dans cette étude, nous avons également constaté que Hic-5 régulait la dissolution du cartilage riche en ECM en tant que régulateur de MMP-13 et que l'inactivation de Hic-5 par l'ARNsi entraînait une atténuation de l'arthrose induite chirurgicalement chez le rat. De plus, l'expression de Hic-5 était élevée dans le cartilage OA humain. Pris ensemble, Hic-5 peut avoir un rôle de régulateur de l'ECM dans le processus de l'arthrose humaine.

Cette étude a révélé la nouvelle découverte selon laquelle le stress mécanique induisait l'expression et la translocation du gène Hic-5 dans les chondrocytes humains. Hic-5 est localisé principalement dans les adhérences focales et se trouve dans le noyau sous stimulation par les ROS dans les fibroblastes humains normaux, et par le TGF-β dans les fibroblastes dermiques humains normaux sans stress mécanique15,19. Cependant, nous avons précédemment montré que Hic-5 passait des adhérences focales aux fibres d'actine après un stress mécanique dans des fibroblastes embryonnaires de souris11. Ces résultats et les données actuelles diffèrent en termes de translocation de Hic-5, ce qui peut être dû aux différentes conditions de contraintes mécaniques et aux différents types de cellules utilisés dans l'analyse.

Dans le cancer colorectal, le Hic-5 accumulé dans le noyau induit l'expression de LOX qui catalyse la réticulation des fibres de collagène pour augmenter la rigidité de la MEC18. De plus, Hic-5 se transloque dans le noyau après un stress mécanique et est impliqué dans l'expression génique des enzymes dégradant la matrice dans les chondrocytes. La stimulation des plaques d'adhérence focale par une rigidité accrue de l'ECM est compatible avec une condition de charge de contrainte mécanique. Pris ensemble, Hic-5 est susceptible de jouer un rôle réciproque dans la régulation de la rigidité microenvironnementale de l'ECM en détectant une augmentation de la rigidité de l'ECM, ce qui conduit à la translocation nucléaire et à l'induction de l'expression génique liée au contrôle de la rigidité de l'ECM. Bien que l'expression du gène Hic-5 ait été légèrement augmentée par le stress mécanique, l'expression de MMP-13 a été significativement supprimée dans les chondrocytes humains. Ces résultats impliquent que la translocation nucléaire de Hic-5 plutôt que l'augmentation de son expression induite par le stress mécanique est importante pour le développement de l'arthrose.

Nous avons précédemment rapporté que Hic-5 régule l'expression du gène c-fos via les sites de liaison AP-1, Ets et Sp120. De plus, il est bien connu que la plupart des membres de la famille MMP ont des sites de liaison AP-1 dans leurs régions promotrices et un inhibiteur sélectif de c-Fos/AP-1 supprime l'expression de MMP-13 dans les chondrocytes humains. De plus, l'administration intra-articulaire de l'inhibiteur supprime l'expression de MMP-13 dans un modèle murin d'arthrose21. Par conséquent, Hic-5 peut favoriser la transcription de MMP-13 en interagissant avec AP-1.

Récemment, diverses études de modèles animaux d'arthrose traités par injection intra-articulaire de médicaments à petites molécules ont été réalisées pour explorer le potentiel de nouveaux médicaments thérapeutiques. Par exemple, l'injection intra-articulaire de dexaméthasone, de rebamipide ou de statines empêche la progression de l'arthrose dans des modèles animaux par une régulation négative de l'expression de MMP-1322,23,24,25,26,27. Hic-5 a été classiquement considéré comme difficile à inhiber par de petits médicaments moléculaires car il s'agit d'une protéine adaptatrice intracellulaire et n'a pas d'activité enzymatique. Cependant, l'inhibition de Hic-5 in vivo a été récemment rendue possible par la thérapeutique des acides nucléiques, un nouvel outil capable d'inhiber sélectivement les gènes à travers les membranes plasmiques. Dans la présente étude, l'injection intra-articulaire d'ARNsi Hic-5 a supprimé la progression de l'arthrose chez le rat. Ainsi, nous avons non seulement identifié Hic-5 comme cible thérapeutique pour l'arthrose, mais également établi que l'ARNsi Hic-5 peut être un nouveau médicament thérapeutique pour l'arthrose.

En résumé, nous avons démontré que Hic-5 régule la dégradation du cartilage en tant que médiateur transcriptionnel de MMP-13. Nos résultats suggèrent que l'ARNsi Hic-5 a une application thérapeutique potentielle, qui peut être cliniquement utile dans l'arthrose.

Des coupes de tissu de cartilage articulaire humain fixées au formol et incluses en paraffine ont été achetées chez ORIGENE (MD, USA). Les cartilages articulaires normaux provenaient de 3 hommes âgés de 36, 52 et 57 ans. 3 cartilages OA provenaient de 2 hommes âgés de 73 et 76 ans et d'une femme âgée de 87 ans. Le cartilage tibial de rat a été fixé dans du formol tamponné à 10 %, décalcifié dans de l'acide formique, incorporé dans de la paraffine et découpé en tronçons de 4 µm d'épaisseur.

Pour l'immunohistochimie, les signaux ont été détectés par le système d'amplification de signal tyramide sans biotine CSAII (Aglient technologies, CA, USA). Les coupes ont été incubées avec un anticorps primaire anti-Hic-5 (1:100 ; 611165, BD Biosciences, NJ, USA) et un anticorps anti-MMP-13 (1:150 ; ab39012, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et contre-colorées avec DAPI ou phalloïdine. Le nombre de cellules positives pour Hic-5 et MMP-13 a été quantifié en comptant les cellules immunopositives dans des coupes sagittales de l'articulation du genou à un grossissement × 200. Le pourcentage de cellules positives a été déterminé à l'aide du logiciel BZ-II Analyzer (Keyence, Osaka, Japon).

Pour l'immunocytochimie, les chondrocytes cultivés ont été fixés dans du formol tamponné à 3, 7% et bloqués avec de l'albumine de sérum bovin à 3% (Sigma Aldrich, Taufkirchen, Allemagne) / solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0, 1% de Tween-20. Les cellules ont été colorées avec l'anticorps primaire à température ambiante pendant 1 h, puis incubées avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor (Invitrogen, MA, USA).

Des chondrocytes articulaires humains normaux obtenus à partir d'un homme de 26 ans et d'un homme de 47 ans ont été achetés chez Lonza et cultivés dans un milieu basal de chondrocytes (Lonza, Bâle, Suisse) conformément aux instructions du fabricant. Les chondrocytes humains du passage 3 à 6 ont été utilisés pour les expériences.

Des chondrocytes humains ont été étalés sur une chambre en silicone recouverte de fibronectine (354008; Corning, NY, USA) à 4 × 104 cellules/chambre. Chaque chambre avait une surface de culture de 2 × 2 cm. Une contrainte de traction cyclique (0, 5 Hz, 10% d'allongement) a été appliquée à l'aide du système d'étirement uniaxial NS-550 (STREX, Osaka, Japon) dans un incubateur à CO2.

Des chondrocytes humains cultivés sur des chambres de silicium ont été transfectés pendant 4 h avec du siRNA Hic-5 (sens : 5ʹ-GGACCAGUCUGAAGAUAAG-3ʹ ; sens inverse : 5ʹ-CUUAUCUUCAGACUGGUCC-3ʹ, 10 nmol/L) ou du siRNA contrôle (10 nmol/L ; Ambion, TX , USA) en utilisant Lipofectamine RNA iMAX (Invitrogen, MA, USA). Ensuite, les cellules ont été lavées avec du PBS et cultivées à 37°C pendant 20h. Ensuite, les cellules ont été soumises à une contrainte de traction cyclique. Pour exprimer une protéine de fusion portant un signal de localisation nucléaire (NLS) au N-terminal de hic-5, un vecteur d'expression NLS hic-5 (NLS-HA-hic-5), qui a été décrit précédemment20, a été transfecté à l'aide de Lipofectamine 3000 (Invitrogen, MA, États-Unis).

L'extraction de l'ARN total et la transcription inverse ont été réalisées avec un kit SuperPrep II Cell Lysis RT pour qPCR (TOYOBO, Osaka, Japon) en suivant les instructions du fabricant. Pour quantifier l'expression de l'ARNm de Hic-5, MMP-13, MMP-1, MMP-2, MMP-3 et TIMP-1, une analyse qPCR en temps réel a été réalisée à l'aide de KOD SYBR q PCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japon) . Les séquences d'amorces sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. L'expression du gène cible a été normalisée en GAPDH à l'aide de la méthode 2-ΔΔCt.

Les protéines ont été extraites de chondrocytes humains à l'aide d'une solution de lyse comprenant 2 % de dodécylsulfate de sodium (SDS). Les protéines ont été fractionnées par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide, transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène et détectées à l'aide d'anti-MMP-13 (1: 1000; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), d'anti-HA (1: 1000; Proteintech, IL, USA ), et des anticorps anti-GAPDH (1:5000; MBL, Tokyo, Japon). Les densités de bandes ont été quantifiées avec le logiciel Densitograph (ATTO, Tokyo, Japon).

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux d'UNITECH Co. Ltd. et menées à UNITECH conformément aux directives éthiques. Toutes les méthodes ont été signalées conformément aux directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org). Des rats mâles Slc:Wistar âgés de sept semaines ont été logés sous un cycle lumineux de 12 h dans une pièce à température contrôlée pendant 1 semaine avant la chirurgie. L'arthrose expérimentale a été induite par MMx28. En bref, une anesthésie a été induite chez des rats [médétomidine (2 mg/kg de poids corporel), midazolam (0,4 mg/kg), butorphanol (5 mg/kg)]. Les genoux et les zones environnantes ont été rasés. Une incision longitudinale a été pratiquée sur la face antérieure du genou droit. Ensuite, nous avons sectionné le ligament collatéral médial et le ligament croisé antérieur du genou droit. Ensuite, le ménisque médial a été retiré. La capsule du genou et le tissu sous-cutané ont été suturés et la peau a été refermée. Le traitement intra-articulaire a été initié 10 jours après la chirurgie. Soit Hic-5 siRNA (avant : 5ʹ-GGAUCAUCUAUACAGCACA-3ʹ ; inverse : 5′-UGUGCUGUAUAGAUGAUCC-3′, 10 nmol/L) (n = 8) ou de l'eau sans nucléase (n = 8) comme véhicule avec AteloGene Local Utilisation Une gélification rapide (Koken, Tokyo, Japon) a été injectée dans les espaces intra-articulaires des articulations du genou du rat conformément au protocole du fabricant. La gravité de l'arthrose a été quantifiée à l'aide du système de notation OARSI d'UNITECH Co. Ltd29,30.

La normalité des données a été évaluée par le test de normalité de Shapiro-Wilk. Lorsque la distribution était normale, le test t non apparié a été utilisé pour comparer deux groupes d'échantillons et une analyse de variance unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Tukey a été utilisée pour comparer les données de plus de trois groupes. Le test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn a été utilisé pour comparer les données non paramétriques de plusieurs groupes. Toutes les analyses ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism. Les résultats sont rapportés sous forme de moyenne ± SEM. Les valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article. Toute autre demande peut être adressée à l'auteur correspondant.

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Nous remercions Mitchell Arico et RJ Frampton, du groupe Edanz (http://www.edanzediting.com/ac) pour l'édition du texte anglais d'un brouillon de ce manuscrit.

Ce travail a été soutenu en partie par la Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI Grant 17K10713 à XF L. et 21K16098 à Ay. M.) et AMED sous Grant Number JP22fk0210089.

Département de biochimie, Showa University School of Medicine, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawa-ku, Tokyo, 142-8555, Japon

Aya Miyauchi, Masahito Noguchi, Xiao-Feng Lei, Momoko Kobayashi-Tanabe, Shogo Haraguchi, Akira Miyazaki et Joo-ri Kim-Kaneyama

Department of Medicine, Division of Gastroenterology, Showa University School of Medicine, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawa-ku, Tokyo, 142-8666, Japon

Masashi Sakaki

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Conception et design de l'étude : JKK et XFL Acquisition des données : Ay.M., MN et MKT Analyse et interprétation des données : MS, SH et AM Rédaction du manuscrit : Ay.M. et JKK Approved version finale du manuscrit : tous les auteurs.

Correspondance à Joo-ri Kim-Kaneyama.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Miyauchi, A., Noguchi, M., Lei, XF. et coll. Le renversement de l'adaptateur mécanosensible Hic-5 améliore l'arthrose post-traumatique chez le rat par la répression de la MMP-13. Sci Rep 13, 7446 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34659-x

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Reçu : 18 février 2023

Accepté : 04 mai 2023

Publié: 08 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-34659-x

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